活性氧(Reactive Oxygen Species多得网，ROS)是细胞有氧代谢过程中产生的一类具有高度化学活性的含氧分子，包括超氧阴离子(\(O_2^-\))、过氧化氢(\(H_2O_2\))、羟自由基(\(\cdot OH\))等。在正常生理条件下，细胞内的 ROS 处于动态平衡状态，参与细胞信号传导、免疫防御等重要生理过程。然而，当细胞受到氧化应激(如辐射、化学毒物、炎症等)时，ROS 的产生会急剧增加，打破氧化 - 抗氧化平衡，导致细胞损伤，与衰老、癌症、神经退行性疾病等多种病理过程密切相关。因此，准确检测细胞内 ROS 水平对于理解细胞生理病理机制至关重要。
二、检测原理细胞 ROS 检测的核心原理是利用 ROS 的强氧化性，通过其与特定检测试剂发生化学反应，产生可被仪器检测的信号，如荧光信号、化学发光信号或吸光度信号等，从而间接反映细胞内 ROS 的水平。不同类型的 ROS 与试剂的反应特性不同，根据检测目的和研究需求，可选择合适的检测方法和试剂。
展开剩余82%三、常见检测方法(一)荧光探针法
原理：荧光探针本身无荧光或荧光较弱，进入细胞后，能被 ROS 氧化或特异性结合，发生结构改变，从而产生强烈荧光。通过检测荧光强度，可定量分析细胞内 ROS 水平。
常用探针
DCFH-DA：是最常用的 ROS 检测探针之一。DCFH-DA 本身无荧光，进入细胞后，被细胞内的酯酶水解生成 DCFH，DCFH 不能透过细胞膜。当细胞内存在 ROS 时，DCFH 被氧化为具有强荧光的 DCF，可通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪检测荧光强度。DCFH-DA 可检测多种 ROS，对\(H_2O_2\)较为敏感，但不能区分不同类型的 ROS 。
DHE：主要用于检测超氧阴离子(\(O_2^-\))。DHE 进入细胞后，可被\(O_2^-\)氧化，形成具有红色荧光的乙锭，嵌入 DNA 中，通过检测红色荧光强度，可特异性反映细胞内\(O_2^-\)的水平。
CellROX 系列探针：具有多种颜色(绿色、橙色、深红色)可供选择，能特异性标记不同细胞器(如线粒体、溶酶体)内的 ROS，并且具有良好的细胞通透性和光稳定性，适用于长时间的 ROS 动态监测。
优点：灵敏度高、操作简便、可实现对单个细胞或细胞群体的检测，还能通过共聚焦显微镜实现细胞内 ROS 的亚细胞定位观察。
缺点：探针的荧光信号可能受细胞内其他物质(如还原剂)的干扰，部分探针的特异性不够强，无法准确区分不同类型的 ROS。
(二)化学发光法多得网
原理：利用 ROS 与特定化学发光试剂反应，产生化学发光信号，通过化学发光仪检测发光强度，从而定量分析 ROS 水平。
常用试剂：鲁米诺(luminol)及其衍生物是常用的化学发光试剂。鲁米诺在过氧化物酶(如辣根过氧化物酶 HRP)和\(H_2O_2\)的存在下，发生氧化反应，产生激发态的 3 - 氨基邻苯二甲酸，当它回到基态时，释放出光子，产生化学发光。通过加入超氧化物歧化酶(SOD)等清除剂，可进一步区分不同类型的 ROS。
优点：灵敏度极高，检测限低，无需激发光，避免了荧光检测中可能存在的背景干扰问题。
缺点：反应是一次性的，无法进行实时动态监测，且化学发光试剂的稳定性相对较差，实验条件要求较为严格。
(三)电子自旋共振(ESR)法
原理：ROS 具有未成对电子，具有顺磁性，在磁场中会吸收特定频率的微波，产生电子自旋共振信号。通过 ESR 波谱仪检测共振信号的强度、位置和形状等参数，可定性和定量分析 ROS 的种类和浓度。
优点：是直接检测 ROS 的方法，具有很高的特异性，能够准确鉴定不同类型的 ROS。
缺点：仪器昂贵，操作复杂，对样品的要求较高，需要专业的技术人员进行操作，且检测灵敏度相对较低，需要较高浓度的 ROS 才能检测到信号。
(四)免疫检测法
原理：利用特异性抗体与细胞内 ROS 修饰的蛋白质、脂质或 DNA 等生物大分子结合，通过免疫组织化学、Western blot 或 ELISA 等方法，检测 ROS 诱导的生物分子损伤程度，间接反映细胞内 ROS 水平。
优点：能够从分子水平研究 ROS 对细胞生物大分子的损伤机制，有助于深入理解 ROS 在疾病发生发展中的作用。
缺点：只能检测 ROS 引起的生物分子损伤的累积效应，不能实时反映 ROS 的动态变化，且抗体的特异性和灵敏度可能影响检测结果。
四、操作流程(以 DCFH-DA 荧光探针法为例)细胞培养：将待检测细胞接种于合适的培养器皿中，在适宜的培养条件下培养至对数生长期。
探针负载：去除细胞培养液，用无血清培养基或 PBS 洗涤细胞 2 - 3 次，加入适量含有 DCFH-DA 的工作液(一般终浓度为 10 - 20 μM)，37℃、5% CO₂培养箱中孵育 20 - 30 分钟。
洗涤：去除负载液，用无血清培养基或 PBS 洗涤细胞 3 次，以去除未进入细胞的 DCFH-DA 探针。
处理细胞：根据实验设计，对细胞进行氧化应激处理(如加入过氧化氢、叔丁基过氧化氢等刺激剂)或给予抗氧化干预(如加入 N - 乙酰半胱氨酸等抗氧化剂)。
检测：将细胞消化收集，重悬于适量的 PBS 中，使用流式细胞仪检测细胞群体的平均荧光强度;或直接将细胞置于荧光显微镜下观察单个细胞的荧光分布和强度;也可使用荧光酶标仪检测细胞裂解液的荧光强度。
五、注意事项探针保存与使用：DCFH-DA 等荧光探针应避光、低温保存，避免反复冻融。工作液需现用现配，以保证探针的活性。
实验对照设置：设置空白对照(未加探针和处理的细胞)、阴性对照(只加探针未进行氧化应激处理的细胞)和阳性对照(加入强氧化剂处理的细胞)，以确保实验结果的准确性和可靠性。
细胞状态：细胞的生长状态和密度对 ROS 检测结果有较大影响，应选用生长良好、状态一致的细胞进行实验。
避免外源 ROS 污染：实验过程中使用的试剂、耗材应尽量避免被外源 ROS 污染，操作应在无菌条件下进行，减少环境因素对实验结果的干扰。
数据分析：使用合适的统计方法对实验数据进行分析，排除异常值，确保结果具有统计学意义。
隆科生物合作项目 分子生物学实验：荧光定量PCR检测、Western blot检测、血常规、生化酶活、 ELISA检测等。细胞实验：耐药细胞株构建、细胞毒性实验、细胞迁移实验、细胞侵袭实验、细胞流式周期检测、细胞流式凋亡检测等。 动物实验：动物模型构建、动物饲养服务、动物临床前研究、药效评价、功能性评价等。 微生物学实验：抑菌试验、药敏试验、菌种鉴定、微生物多态性分析等实验。 病理检测：石蜡包埋、切片、HE染色、masson染色、番红固绿染色、天狼星红染色、免疫组化、免疫荧光单标/双标/多标、全景扫描、激光共聚焦拍照等。发布于：山东省汇盈策略官网提示：文章来自网络，不代表本站观点。
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